利用国产冷冻断裂样品制备系统的水凝胶表征工作流程

关键词：水凝胶，冷冻电镜样品制样流程，

          扫描电镜表征，三维网络结构样品

产品展示:

图1.(a) Long Scope LNS210 冷冻液氮泥工作台Thermo Fisher定制版, (b) Long Scope MSC310 真空冷冻制样舱Thermo Fisher定制版, (c) Thermo Fisher 冷冻传输杆Transfer Rod

   水凝胶是由亲水聚合物链，经物理或化学交联构成的三维（3D）网络结构材料。其定义特征是能够吸收超过其干质量数十倍的水，同时保持结构完整，从而形成独特的“软湿”状态。这种状态赋予了水凝胶仿生的机械性能，与生物组织（例如软骨、皮肤）的高度兼容性，使其成为生物医学应用的理想基底材质。水凝胶的微观结构，例如关键的3D网络参数——包括孔径分布、交联密度和表面形貌——直接决定水凝胶的关键性能，如溶胀动力学、机械强度和功能性能（例如，控制药物释放效率、细胞响应）。

扫描电子显微镜（SEM），可提供亚微米到纳米级分辨率（5-10 nm），在解析水凝胶微观/纳米级拓扑形态方面是不可或缺的。然而，传统的水凝胶SEM表征仍面临三个基本的物理冲突：

      真空引发的脱水坍塌：水凝胶的高含水量（>90 wt%）与自由水的高挥发性之间存在固有矛盾，导致网络坍塌和孔变形。传统的冷冻干燥由于气-固界面张力，造成孔壁断裂和显著的孔收缩（收缩率>30%），使得观察的形貌不真实，测量的尺寸不准确。特别是离子交联系统容易受到脱水引发的玻璃化转变影响。

      电子束敏感性与成像保真度：水凝胶对电子辐射的敏感度高。高加速电压（>10 kV）电子束照射会导致水凝胶交联断裂和表面开裂，而低电压模式（5-10 kV）虽可减轻辐射损伤，但也会显著降低分辨率和信噪比（SNR）。

      冷冻制备影响和定位不准确：传统高压冷冻制备的样品受到晶体冰形成的膨胀应力，导致网络撕裂。高压辅助玻璃化（2,100 bar）可抑制冰晶形成，但对样品厚度有严格限制（≤100 μm），易导致相分离。随机冷冻断裂面分布导致目标区域定位错误。过度升华蚀刻（例如，温度>-90°C）引起孔壁坍塌和微孔合并。深孔由于电子束穿透不足，导致荷电效应。低真空SEM模式部分减轻荷电，但分辨率（>20 nm）也因此而损失。

图2. 冷冻干燥后的水凝胶样品SEM图片，显示出样品制备中3D网络结构的严重破损。

本应用说明介绍了一种新的水凝胶SEM样品制备方法。利用上述国产冷冻断裂样品制备系统，该方法系统地解决了“软湿性质与刚性表征”冲突，能够观察水凝胶原位3D网络结构。它为膨胀状态微结构的原位分析提供了技术上全面且操作上可控的解决方案。

      1. 预冷 MSC310 真空冷冻制样舱和冷冻扫描电子显微镜1.(cryo-SEM)样品台，分别使用液氮(LN2)至约-180°C和-165°℃。

      2. 向 LNS210 冷冻液氮泥工作站添加 LN2，并启动抽真空以生成液氮泥。同时，准备水凝胶样品:选择一小薄片水凝胶并将其紧密安装在样品台上，确保水凝胶与铜质样品台表面最大接触，以保证后续升华效率。

步骤2:在液氮泥中快速冷冻固定

      在 LNS210 中将水凝胶样品冷冻固定，并将样品台转移到Thermo Fisher 冷冻传输杆Transfer Rod。样品被转移到 MSC310 真空冷冻制样舱进行后续样品制备操作。

步骤3:冷冻断裂、升华、镀膜和冷冻扫描电子显微镜观察

      1.将样品台从 IGST 转移到 MSC310 真空冷冻制样室。

      2.在 MSC310 内:

• 装载样品

• 进行冷冻断裂以暴露出断裂面

• 在 -90°℃ 下升华表面污染物/冰20分钟(根据样品性质确定升时间)。选定金属箔靶材，通过离子束蚀刻进行导电镀膜(根据不同样品性质确定靶材和镀膜时间)。

     3.将镀膜后的水凝胶样品转移回Thermo Fisher 冷冻传输杆Transfer Rod，随后进行 cryo-SEM观察。

图3. 使用冷冻断裂样品制备系统制备水凝胶样品的工作流程。

  按照此工作流程制备的水凝胶样品的典型低电压模式扫描电子显微镜（SEM）图像如图4、图5所示。

      综上所述，这套以低温玻璃化、冷冻传输和冷冻镀膜为核心的工作流程系统地克服了水凝胶的“软湿特性与刚性表征要求”之间的物理冲突。它为膨胀状态下纳米级微结构的原位分析提供了一种技术上全面且操作可控的解决方案。