CLEM的新工具：CryoCapsule

     将同一物体的互补多尺度图像进行关联是解析生物过程的一种直接方法。光学显微镜和电子显微镜作为最常用的成像技术，尽管具有互补性，但其相关联的实验流程在技术上仍较为复杂。为此，我们设计并制造了一种适用于多种生物样本的新装置——CryoCapsule，该装置显著简化了当前将活细胞荧光成像与高分辨率电子显微成像分离所需的多步骤样品制备过程，从而为实现全面相关的光镜与电镜成像提供了新的策略。我们进一步利用这一高度优化的工具对三种不同的生物样本进行了测试：体外非洲爪蟾（Xenopus laevis）有丝分裂纺锤体、过表达YFP-Langerin且被隔离于膜状亚细胞器中的黑色素瘤细胞，以及内体系统通过内化荧光转铁蛋白标记的黑色素细胞。

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光电光联显微技术（CLEM）旨在弥补光学显微镜（LM）和电子显微镜（EM）在时间和分辨率上的差距。

      在光电光联显微（CLEM）技术中，一个关键步骤是将样本固定在激光显微镜（LM）和电子显微镜（EM）之间。随着电子显微镜在细胞生物学领域的不断发展，化学固定法因其操作简便、成本低廉且节省时间而被广泛研究，用作超微结构观察的一种便捷方法。但化学固定法的固有缺陷限制了在 CLEM 视角下对动态事件及其在电子显微镜水平上的超微结构的解读，具体表现为：

（i）样本固定的速度较慢（取决于样本的厚度和成分，从几秒到几分钟不等）；

（ii）化学诱导的超微结构变化（膜网断裂、超微结构重组、脱水收缩和样本的嵌入）；

（iii）对某些样本（如秀丽隐杆线虫幼虫在 10% 甘油醛溶液中能活动几小时）固定效率低下；

（iv）荧光淬灭。

HPM Live μ 高压冷冻仪     

      要建立一个具有生物学意义的 CLEM 工作流程，必须先通过动态荧光显微镜快速获取图像，然后进行冷冻固定，再进行电子显微镜观察。然而，高压冷冻机（HPM）是复杂的大型设备，其中发生玻璃化冷冻的高压冷冻室体积小、空间受限且难以接近。为了确保标本装载的准确性，需要组装多个适配器来延迟转移过程，从而缩短 CLEM 方法的生物学相关时间尺度。加速和改进 CLEM-HPF 需要开发与高端光学显微镜标准兼容、能够物理支持 HPF 过程并便于将标本转移到电子显微镜中的工具。这些工具将提高从最后的光学显微镜图像到 HPF 之间的时间分辨率，并确保达到高端电子显微镜的标准。

      我们开发了“CryoCapsule”这一装置，旨在加快、简化并标准化整个光电光联显微技术（CLEM）工作流程中的样本操作。在手动将生物样本从光学显微镜转移到高功率微流控芯片（HPM）之前，我们先对其进行了 5 分钟的成像处理。我们尽可能将非热传导质量降至最低，从而在不添加冷冻保护剂的情况下，在培养基中实现冷冻固定，以保持细胞生理机能。新的 HPM 适配器设计用于在冷冻前防止物理应力。最后，冷冻胶囊的形状便于在整个 CLEM 过程中处理各种样本，直至进行目标超薄切片。大多数电子显微镜方法的后期样本准备步骤与此类似。我们极大地简化并加速了样本准备过程，并提高了实验的可重复性。

      为了在生物层面上测试“CryoCapsule”的性能，我们测试了三种不同的样本：一种脆弱的体外标本、一种非洲爪蟾分裂体（被描述为对压力敏感）、一种过度表达带有 YFP 标签的 Langerin 的黑色素瘤细胞（M10 细胞），其产生了清晰可见的由电子显微镜（EM）观察到的膜层结构，以及一种黑色素细胞系（MNT-1 细胞），我们通过荧光标记的转铁蛋白与内源性转铁蛋白受体的结合来追踪其内吞体网络。

详细图解

A）冷冻舱置于一枚 1 欧元硬币顶部的图片，以展示其相对比例；比例尺：4.5 毫米。

B）正面（左）和背面（右）的放大视图展示冷冻舱。同心排列的塑料环（1）、金箔环（2）和标有标记的基底片状物（3）；比例尺：0.5 毫米。

C）冷冻舱的扫描电子显微镜图像；比例尺：2 毫米。

D）冷冻舱的放大侧视图。

E）冷冻舱的三维横截面视图。基底片状物、金箔环和嵌入塑料环中的覆盖物（3）保持在一起。

F）冷冻舱的放大三维视图。覆盖物（3）与塑料环不接触，位于金箔环之上。两块基底片状物和金箔环之间是 CLEM 装置。

      “CryoCapsule”是一种集成技术，它简化了在高压冷冻电子显微镜（HPF-CLEM）方法中对生物样本的操作过程。

图例2 CryoCapsule的详细图解

A) 正在使用的CryoCapsule的示意图：CryoCapsule的基底吸附盘上的碳蒸发层已经通过一个定位网格掩模进行了标记。在完成一次实验的消毒处理（1）后，样本（红色星号）被加载（2），一个直径为 2.5 毫米的覆盖吸附盘（蓝色箭头）被沉积下来以封装样本（3），从而形成了一个 CLEM 装置。

C) 可能用于相关方法的蓝宝石组装：将生物样本沉积到一个已标记的基底吸附盘上（1），在上面放置一个盖子（2），然后在其上放置一个直径为 3 毫米的覆盖蓝宝石盘（3）。

D-F) 在 CLEM 装置组装完成后，样本将被准备用于活细胞成像，以便在高压荧光（HPF）之前确定感兴趣结构。D 和 E) 冷冻舱被装入底部有孔的潮湿舱室中，以便直接使用长工作距离进行成像。距离目标（1）：在对样本进行识别后，将冷冻胶囊收集起来，并安装到 HPM010 尖端（2）中用于 HPF。E）将冷冻胶囊夹入 HPM100 中间板适配器中（1；加载适配器的正反两面的图片）。F）将蓝宝石组件置于玻璃底部潮湿箱中（1）以识别感兴趣区域。该组件安装在两个铝制支架之间（2），并在进行 HPF 之前加载到 HPM 外部适配器中（3）。

G）将CryoCapsule转移到冷冻替代溶液中（a），并轻轻移除覆盖的石英盘（仅操作塑料环和覆盖的石英盘（b））。定位是通过读取碳字母或面对金环向上（c）完成的。经过嵌入后，移除软塑料环（d）后，石英盘将变得可访问，以便进行仔细的物理移除（e；无需热冲击）。碳图案转移到树脂上，以便进行方便的靶向超薄切片（图片）。H）将蓝宝石组件转移到冷冻替代溶液中（a），并拆卸以收集基底石英盘（b）。样品的定向处理完全通过读取碳标记字母（c）来完成。在进行嵌入操作后，需对石英盘进行清理（d），然后通过热冲击或机械方式将其取出（e）。碳图案转移用于实现有针对性的超薄切片（f）。